1723-ban Nápolyba került a Conservatorio dei Poveri di Gesù Cristóba, ahol 1725-től már fiú-szoprán énekes, 1729-30-ban pedig elsőhegedűs és segédtanár volt az intézményben. Operaszerzői pályafutása 1731-ben indult útnak Salustia című opera seriája előadásával. 1732-től Pergolesi Nápolyban Stigliano herceg karmestere lett, és itt került bemutatásra nápolyi dialektusban írt Lo frate 'nnamorato című komédiája, amely Gennaro Antonio Federico nyomán készült.
1733-ban az Il prigioniero superbo című opera seriát vitték színre. Ennek a darabnak a felvonásszüneteibe iktatta be Pergolesi a La serva padrona (Az úrhatnám szolgáló) című buffo intermezzóját, amelynek elsöprő sikere a műnek tartós népszerűséget biztosított.
A mű korszakalkotó jelentősége többek között abban mutatkozik meg, hogy a francia opéra-comique előképe volt, s Párizsban 1752-ben ez a darab robbantotta ki buffonisták harcát.
Az operaháborúk a XVIII. század közepének nemcsak kulturális megmérettetései voltak, de mind a zeneszerzők, mind a párizsi közönség számára jelentős politikai tartalommal bírtak.
1752-ben a párizsi operaház itáliai opera buffonistákat hívott meg a szezon idejére, felkavarva ezzel az állóvizet. A egyébkénit is más utakon járó francia operákat már kívülről ismerte a közönség, akár Jean-Baptiste Lully vagy zenei örököse, Jean-Philippe Rameau műveiről volt szó. A buffonista társulat Giovanni Battista Pergolesi Az úrhatnám szolgáló című művével nyitott, amely színes produkciója miatt csaknem két éven át tartó szembenállást eredményezett az olaszbarát buffonisták és a konzervatív francia testület között. A buffonisták élén a híres francia filozófus, Jean-Jacques Rousseau állt, aki a pamfletírók mérgesítette helyzet után 1753-ban gúnyosan ítélt el mindent, amit a francia zene képviselt. Viszonzásképp a párizsi opera zenészei elégették a filozófus képmását.
Utolsó opera seriáját, az Adriano in Siriát 1734-ben mutatták be Nápolyban. Még ebben az évben Pergolesi Maddalani herceg szolgálatába állt Rómában. Ehhez az időszakhoz fűződik F-dúr miséje és L'Olimpiade című operája (1735). Ezt követően a szerző a pozzuoli ferences kolostorba ment, s itt írta utolsó művét, a Stabat Matert. Gyermekkora óta tartó hosszú betegeskedés után itt hunyt el alig 26 évesen.