Budapesten a Teleki téren nőtt fel. Szülei papírhulladékkal kereskedtek, és amikor az üzlet tönkrement, tizennégy évesen dolgozni kezdett, hogy a családon segítsen. A SZOT Művészegyüttesben népi táncos volt, onnan jelentkezett a Színház- és Filmművészeti Főiskolára, ahova nyomban felvették, méghozzá érettségi nélkül. Az ő korosztálya volt az utolsó, amely megkapta ezt a lehetőséget: papír nem kell, elég a tehetség. Tanára volt Gellért Endre, Básti Lajos, Várkonyi Zoltán, osztálytársa Törőcsik Mari, Bodrogi Gyula, Fülöp Zsigmond, Fonyó József. 1958-as vizsgaelőadásukat, Brecht Koldusoperáját az évad színházi revelációjaként értékelték.

Pályája során sok színpadon bizonyította tehetségét, rátermettségét. Első munkahelye a Pécsi Nemzeti Színház volt. 1962-től a Kecskeméti Katona József Színházban, 1963-tól a budapesti Petőfi Színházban, 1965-től a Miskolci Nemzeti Színházban játszott. 1968-tól a Mikroszkóp Színpad, 1970-től a Szegedi Nemzeti Színház, 1972-től a budapesti József Attila Színház, 1978-tól a szolnoki Szigligeti Színház tagja volt. 1982-ben lett a Magyar Filmgyártó Vállalat, 1990-ben pedig újra a Miskolci Nemzeti Színház társulatának a tagja. 1999-től a Győri Nemzeti Színház foglalkoztatta, majd szabadúszó lett. 1992 és 1996 között a Magyar Színészkamara ügyvivőjeként is tevékenykedett.

Margitai Ági színes, energikus egyénisége, jellegzetes, érdes hangja kiválóan érvényesült vígjátéki és drámai szerepekben egyaránt. Játszott az Egy szerelem három éjszakája ősbemutatójában - ez látható videónkon is -, alakította Elizát Shaw Pygmalionjában, Katát Shakespeare A makrancos hölgy című színművében, Máknét Fejes Endre Vonó Ignácában, Násztyát Gorkij Éjjeli menedékhelyében vagy Aquitániai Eleonórát Goldman Az oroszlán télen című darabjában. A színésznő 2001-ben rendezőként is bemutatkozott LaBute Szentek fecsegése című darabjának színrevitelével.

Szerepet kapott számos filmben, többek között a Fiúk a térről (1967), a Sárika, drágám (1971), a Herkulesfürdői emlék (1977), a Szabadíts meg a gonosztól (1979), a Circus Maximus (1980), a Ripacsok (1981) vagy a Franciska vasárnapjai (1997) című moziban. Tévéfilmekben is feltűnik markáns egyénisége, például a 2008-as Presszó című sorozatban.

Margitai Ági szereti az alternatív, kísérletező színházcsinálást, de bárhol otthon tud lenni, akár nagy múltú kőszínházról, akár alkalmilag összeverbuvált csapatról van szó. Pályája során akkor sem esett kétségbe, ha kevesebb színészi feladata volt. Felnőtt fejjel kezdett el nyelveket tanulni, mondván, hogy így könnyebben hódolhat kedvenc hobbijának, az utazásnak. A "Mi a célja" kérdésre egy interjúban így válaszolt: emberséget adni.

Margitai Ági művészi tevékenységét 1962-ben Jászai Mari-díjjal jutalmazták. 1981-ben lett érdemes művész, 1989-ben kiváló művész, 1995-ben pedig Déryné-díjat kapott. 2006 óta örökös tagja a Halhatatlanok Társulatának. 2010-ben több mint negyvenéves, sokoldalú művészi pályája elismeréseként Kossuth-díjjal tüntették ki.

"Nem vész el, amit eddig átéltél, nem kell semmivé tenni, ami gyönyörű volt az életben. Lehet ragaszkodni az emlékekhez, jó érzés visszagondolni, de nem szabad csak abból élni. Amíg minden megy tovább, előre kell nézni, nem hátra" - vallott életfilozófiájáról a Fideliónak a Sírpiknik című előadásban játszott karaktere kapcsán a színésznő, aki 2012-ben a Pécsi Országos Színházi Találkozón a színészzsűri tagja volt.